Peter Parker / Spider-Man (Jake Johnson): Peter Parker chắc chắn là cái tên quen thuộc nhất trong số các Người Nhện đối với khán giả đại chúng bởi các bộ phim điện ảnh trước đây đều xoay quanh anh. Trong bộ phim hoạt hình mới, khi các vũ trụ hòa làm một, khán giả có cơ hội gặp gỡ Peter ở tuổi ngoài 40, với chiếc lưng đau mỏi, bụng phệ, và ý chí chiến đấu đôi phần giảm sút. Nhân vật bất đắc dĩ trở thành “sư phụ” cho Spider-Man “nhí” Miles Morales, với mong muốn cậu học trò có thể tránh được những sai lầm của mình trong quá khứ.
Miles Morales / Spider-Man (Shameik Moore): Trung tâm của Spider-Man: Into the Spider-Verse thực chất là cậu bé da màu người gốc Latin, sinh sống tại khu Brooklyn, New York. Phiên bản này của Người Nhện mới ra đời trên truyện tranh từ 2011. Miles trở thành Spider-Man sau khi chứng kiến siêu anh hùng nhả tơ bỏ mạng khi đối đầu với tên Green Goblin ở dòng thời gian của cậu. Do đó, Miles Morales thấy rất sốc khi gặp Peter Parker của một vũ trụ khác.
Gwen Stacy / Spider-Gwen (Hailee Steinfeld): Năm 2014, các tác giả nghĩ ra câu chuyện để cô bạn gái của Peter Parker bị nhện cắn, rồi trở thành siêu anh hùng Spider-Gwen. Giống như Miles Morales, Gwen Stacy là con của một cảnh sát. Ở vũ trụ của cô, Peter biến thành Lizard sau một thí nghiệm thất bại, còn bản thân cô gái bị buộc tội cho cái chết thảm của chàng trai. Ngoài ra, cũng trong dòng thời gian ấy, Daredevil ra lại là một kẻ ác. Xuất hiện trong Spider-Man: Into the Spider-Verse, Gwen Stacy có thể trở thành bạn gái của Miles Morales.
Peter Parker / Spider-Ham (John Mulaney): Đây thực chất là phiên bản giễu nhại Spider-Man do hai nghệ sĩ Tom DeFalco và Mark Armstrong sáng tạo ra vào năm 1983. Ban đầu, Peter thực tế là một chú nhện. Nhưng trong một thí nghiệm thất bại, chú bị con lợn nhiễm phóng xạ cắn phải. Kết quả là nhân vật trở thành chú lợn mang vóc dáng giống con người nhưng mang sức mạnh của nhện, và lấy họ là Porker.
Peter Parker / Spider-Man Noir (Nicolas Cage): Nhân vật Người Nhện đen tối ra đời trong vũ trụ truyện tranh lấy bối cảnh thời kỳ Đại Khủng hoảng năm 1933 có tên Marvel Noir. Peter Parker lúc này là một phóng viên ít kinh nghiệm nhưng giàu nhiệt huyết. Anh cũng bị nhện cắn khi đang thực hiện một phóng sự điều tra. Sau sự kiện, Peter trở thành siêu anh hùng, quyết tâm chống lại các băng đảng khét tiếng ở New York, nhưng với cách thức hành động cực kỳ dã man nếu so với các phiên bản Người Nhện khác. Spider-Man Noir sẽ xuất hiện trong phim qua sự lồng tiếng của Nicolas Cage.
Peni Parker / SP//dr (Kimiko Glenn): Mới trình làng độc giả hồi 2014 qua mini-series Edge of the Spider-Verse, đây là phiên bản Người Nhện trẻ trung nhất. Cô bé Peni Parker mất cha khi mới 9 tuổi và được dì May cùng bác Ben nhận về chăm sóc. Sau đó, Peni phát hiện ra rằng mình có thể điều khiển bộ giáp SP//dr do sở hữu cùng mã gene với cha. Một phần SP//dr vốn được điều khiển bởi con nhện nhiễm phóng xạ, giúp người dùng mang sức mạnh của siêu anh hùng nhả tơ. Ở vũ trụ của Peni Parker, đối thủ lớn nhất của bé là Addy Brock - cô bạn cùng lớp sau này sở hữu bộ giáp VEN#m.
Spider-Man: Into the Spider-Verse là tác phẩm hoạt hình lấy Miles Morales làm trung tâm. Cậu bé da đen đang loay hoay tìm cách cân bằng giữa việc trở thành siêu anh hùng Người Nhện với đời sống học đường và những vấn đề thường nhật. Mọi chuyện càng trở nên phức tạp khi hàng loạt Người Nhện đến từ các vũ trụ khác bỗng nhiên xuất hiện.
Thành công phòng vé ngoài mong đợi của bộ phim “Venom” khiến cuộc “trở về nhà” của Spider-Man ở Vũ trụ Điện ảnh Marvel (MCU) đứng trước nguy cơ sớm chấm dứt.
